Hani Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Kohët e fundit është treguar se kërpudhat ascomycete Ilyonectria crassa është e aftë të infektojë zhardhokët e patates. Kjo punë është e para për të analizuar karakteristikat biologjike dhe rezistencën ndaj disa fungicideve të llojit I. crassa të izoluar nga patatet. Sekuencat e rajoneve specifike të specieve të llojit "patate" përkuan me ato të marra më parë për kërpudhat e izoluara nga rrënjët e daffodil, xhensen, aspen dhe ah, llamba të zambakut dhe gjethe tulipani. Me sa duket, shumë bimë të egra dhe kopsht mund të jenë rezervat e I. crassa. Tensioni i hetuar ka infektuar feta domate dhe patate, por nuk ka infektuar të gjithë frutat e domates dhe zhardhokun e paprekur të patates. Kjo tregon se I. crassa është një parazit plagë. Vlerësimi i rezistencës ndaj fludioxonil, difenoconazole dhe azoxystrobin në një lëndë ushqyese tregoi efikasitet të lartë të këtyre barnave.
Treguesi EC50 (përqendrimi i fungicidit, i cili ngadalësohet me 2 herë shpejtësinë e rritjes radiale të kolonisë krahasuar me kontrollin jo-fungicid) ishte i barabartë me 0.4; Respektivisht 7.4 dhe 4 mg / l. Mundësia e zhvillimit të sëmundjes së shkaktuar nga I. crassa duhet të merret parasysh gjatë vlerësimit fitopatologjik të zhardhokëve të patates dhe zhvillimit të masave të mbrojtjes së bimëve.
Zhvillimi i mikroorganizmave fitopatogjene çon në humbje të mëdha në të gjitha fazat e rritjes dhe ruajtjes së patateve. Kur planifikoni masa mbrojtëse, si rregull, merren parasysh patogjenë të njohur, të tilla si speciet e gjinive Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, etj. Sidoqoftë, në vitet e fundit, gjithnjë e më shumë raporte janë shfaqur në lidhje me shfaqjen e mikroorganizmave të rinj fitopatogjene në patate. Biologjia e tyre është studiuar dobët, efektiviteti i fungicideve të përdorura në patate në lidhje me to është i panjohur, metodat diagnostike nuk janë zhvilluar. Me zhvillimin masiv, ata janë të aftë të shkaktojnë dëme të konsiderueshme në kulturen e patates. Një prej këtyre mikroorganizmave është kërpudha ascomycete Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, zbuluar së pari nga autorët në zhardhokët e patates (Chudinova et al., 2019).
Kjo punë paraqet rezultatet e analizës së sojës I. crassa të izoluar nga zhardhokët e patates. U studiuan morfologjia e kolonive dhe strukturave miciale të I. crassa, sekuencat nukleotide të rajoneve specifike specifike të ADN-së, virulenca ndaj patateve dhe domateve dhe rezistenca ndaj disa fungicideve të njohura.
Materiale dhe metoda
Ne përdorëm sojin I. crassa 18KSuPT2 të izoluar në 2018 nga zhardhoku i patates së prekur i rritur në rajonin e Kostroma. Zhardhoku u prek nga një lloj kalbësie e thatë me një zgavër të mbuluar me micelium kafe të lehta. Duke përdorur një gjilpërë shpërndarëse sterile, miceli i kërpudhave u transferua në një enë Petri me një mjedis agar (birrë 10%, agar 1.5%, penicilinë 1000 U / ml). Pllakat u inkubuan në errësirë në 24 ° C.
Një mikroskop dritë Leica DM2500 me një aparat fotografik dixhital ICC50 HD dhe një mikroskop dylësh Leica M80 me një aparat fotografik dixhital IC80HD (Leica Microsystems, Gjermani) u përdorën për të fotografuar, vlerësuar madhësinë dhe morfologjinë e sporeve dhe organeve të sporeve.
Për të izoluar ADN-në, miceli i kërpudhave u rrit në mjedis të lëngshëm bizele, pastaj u ngrinë në azot të lëngët, u homogjenizua, u inkubua në tampon CTAB, u pastrua me kloroform dhe u la dy herë me 2% alkool.
Metoda e nxjerrjes së ADN-së përshkruhet në detaje në artikullin nga Kutuzova et al. (2017)
Për të përcaktuar speciet me metoda molekulare dhe krahasuar me shtame të tjera të njohura I. crassa, PCR u krye me abetare që lejuan amplifikimin e rajoneve specifike specifike të ADN-së: ITS1-5,8S-ITS2 (abetaret ITS5 / ITS4, White et al., 1990), rajonet e gjeneve b -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) dhe faktori i zgjatimit të përkthimit 1α (tef1α) (abetaret EF1-728F / EF1-986R, Carbone dhe Kohn, 1999). Amplikonët e gjatësisë së dëshiruar u nxorën nga xheli duke përdorur çantën Evrogen CleanUp. Rajonet e amplifikuara u sekuencuan duke përdorur BigDye® Terminator v3.1 Ciklin Sequency Kit (Applied Biosystems, CA, USA) në një Aplikuar Biosystems 3730 xl sekuencues të automatizuar (Applied Biosystems, CA, USA). Sekuencat nukleotide që rezultojnë u përdorën për të kërkuar një ndeshje në bazën e të dhënave GenBank të Qendrës Kombëtare të SHBA për Informacionin e Bioteknologjisë (NCBI). Analiza filogjenetike u krye duke përdorur programin MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
Përcaktimi i virulencës u krye në fruta të gjelbërta të domates me fruta të mëdha (shumëllojshmëria Dubrava) dhe zhardhokët e patates (varieteti Gala). Përveç kësaj, për të simuluar dëmtimin e frutave dhe zhardhokëve të dëmtuar, ne përdorëm feta të të njëjtave fruta dhe zhardhokë. Fetë zhardhokësh u vendosën në dhomat e lagështa, të cilat ishin enët Petri me letër filtri të lagur në pjesën e poshtme. Në letër u vendos një diapozitivë, në të cilën, nga ana tjetër, ishin vendosur feta zhardhokësh ose frutash. Zhardhokët dhe frutat e tëra gjithashtu u vendosën në kontejnerë me letër filtri të lagur në pjesën e poshtme. Në qendër të fetë (ose në sipërfaqen e paprekur të zhardhokut ose frutave), një copë agar (5 × 5 mm) me hifa kërpudhore u vendos pas 5 ditësh rritje në agar.
Vlerësimi i rezistencës së shtameve të kërpudhave ndaj fungicideve u krye në kushte laboratorike në mjedisin ushqyes agar. Ne studiuam ndjeshmërinë ndaj ilaçeve fungicid Maxim, KS (përbërës aktiv fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenoconazole 250 g / l) (Katalogu shtetëror ..., 2020). Vlerësimi u krye në enët Petri në medium-agar me shtimin e ilaçeve të studiuara në përqendrimet e substancës aktive 0.1; një; 1 ppm (mg / L) (për fludioxonil dhe difenoconazole), 10; dhjetë; 1 ppm (për azoksistrobinë) dhe në media pa fungicid (kontroll). Fungicidi u shtua në shkrirjen dhe u ftoh në mjedisin 10 ° C, pas së cilës mediumi u derdh në enët Petri. Një bllok agar me miceli kërpudhor u vendos në qendër të një pjate Petri dhe u kultivua në një temperaturë prej 100 ° C në errësirë. Pas 60 ditëve të inkubacionit, diametrat e kolonive u matën në dy drejtime reciprokisht pingule; rezultatet e matjes për secilën koloni ishin mesatare. Eksperimentet u kryen në tre kopje. Bazuar në rezultatet e analizave, është llogaritur EC24, e barabartë me përqendrimin e fungicidit, i cili përgjysmoi shpejtësinë e rritjes radiale të kolonisë në krahasim me kontrollin fungicid.
Rezultate dhe diskutime
Në enët petri me agar mishi, kërpudhat formuan koloni me micelium të bardhë flokulent. Mesatarja nën miceli u kthye në të kuqe-kafe. Kur mediumi thahet, kërpudhat formuan spore të dy llojeve në konidiofore të vetme dhe të grumbulluara në sporodokinë e vogël. Makrokonidiet janë të zgjatura, cilindrike, me një deri në tre septa, gjatësi mesatare 27.2 μm me një sërë vlerash nga 23.2 në 32.2 μm, gjerësi - deri në 4.9 μm (Fig. 1). Gjatësia mesatare e mikrokonidisë është 14.3 μm me një sërë vlerash nga 10.3 në 18.1 μm, gjerësia është deri në 4.0 µm. Të gjithë personazhet makro dhe mikromorfologjikë përshtaten në rangun e variacionit të specieve Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Sekuencat e rajoneve specifike specifike të ADN-së (ITS, b-tubulin, TEF 1α) përkuan plotësisht me sekuencat e shtameve I. crassa që kemi studiuar më parë (Chudinova et al., 2019, Tabela 1). Për të studiuar prevalencën e I. crassa në rajone të tjera dhe për të analizuar spektrin e kulturave të prekura, sekuencat analoge të ADN-së në bazën e të dhënave GenBank u analizuan (Tabela 1). Mbivendosja ishte 86 deri 100%. Sekuencat e të tre rajoneve të ADN-së të llojit "patate" I. crassa ishin identike me sekuencat e shtameve të izoluara nga llamba e zambakut dhe rrënjët e narcisit në Hollandë dhe nga rrënja e xhensenit në Kanada. Ne nuk arritëm të gjenim shtame të tjera I. crassa me tre sekuenca të ngjashme të analizuara në bazat e të dhënave të hapura. Sidoqoftë, analiza e sekuencave të saj të depozituara dhe b-tubulinës tregoi praninë e I. crassa në gjethet e tulipanit në MB. Kërpudhat me një sekuencë të ngjashme të TIJ u identifikuan kur analizuan mikobiotën e rrënjëve të aspenit në Kanada dhe rrënjët e ahut në Itali dhe zhardhokët e patates në Arabinë Saudite (Tabela 1). Rezultatet e këtij studimi tregojnë se I. crassa ka një shpërndarje globale dhe është e aftë të infektojë lloje të ndryshme bimësh.
Gjatë përcaktimit të patogjenitetit në feta domate dhe patate në ditën e 5-të, diametri i plagës arriti në 1.5 cm. Tipi i hetuar nuk infektoi tërë frutin e domates dhe zhardhokun e patates së paprekur. Sidoqoftë, sepalet u prekën në domate. Për të përjashtuar mundësinë e ndotjes nga miceli i zhvilluar në fetë e zhardhokut të patates, një izolim i kërpudhave u izolua në një kulturë të pastër. Ishte plotësisht identike me llojin e prindërve. Me sa duket, I. crassa është një parazit plagë.
Trajtimi para mbjelljes së zhardhokëve të farës me fungicide zvogëlon zhvillimin e sëmundjeve në bimë gjatë sezonit të rritjes. Për zgjedhjen e fungicideve efektive, është e rëndësishme të vlerësohet se cilët prej tyre janë efektivë kundër I. сrasa. Puna studioi substancat aktive të përhapura të fungicideve - fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazole. Fludioxonil është formuluar në disa përzierje të përdorura për veshjen e farave dhe zhardhokëve të farës para mbjelljes. Fludioxonil (Maxim) përdoret gjithashtu për të trajtuar zhardhokët e farës para ruajtjes. Difenoconazole dhe azoxystrobin përfshihen gjithashtu në një numër përgatitjesh të përdorura për përpunimin e materialit farë, si dhe në përgatitjet e destinuara për përpunimin e bimëve vegjetative (Katalogu shtetëror ..., 2020).
Shkalla e rritjes së I. crassa u studiua në media (Fig. 2) me përqendrime të ndryshme të substancave aktive: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoksistrobinë (EC50 = 4 ppm) dhe difenokonazol (EC50 = 7.4 ppm) (Tabela 2). Këto përgatitje mund të konsiderohen shumë të efektshme kundër I. crassa, pasi që EC50 e tyre është dukshëm më e ulët se përqendrimi i rekomanduar i preparatit në lëngun punues të përdorur për trajtimin e zhardhokëve. Sipas Katalogut Shtetëror ... (2020), përqendrimi i fludioxonil në lëng për trajtimin e zhardhokëve të patates është nga 500 në 1000 ppm, azoxystrobin (në lëng për trajtimin e pjesës së poshtme të brazdës) - 3750-9375 ppm, difenoconazole (në lëng për trajtimin e bimëve vegjetative) - 187.5– 625 ppm.
Tabela 1. Ngjashmëria e sekuencave të sekuencave specifike të specieve të llojit 18KSuPT2 dhe llojeve të Ilyonectria crassa të disponueshme në bazën e të dhënave Genbank
Tendosje | Bimore pritëse, vendi i sekretimit | Numrat e sekuencave të depozituara në GenBank, përqindja e ngjashmërive | Lidhje | ||
SAJ | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 dhe 18KSuPT2 | Zhardhoku i patates, rajoni i Kostromës | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, kjo vepër |
CBS 158/31 | Rrënjët e Narcisit, Hollandë | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Llambë zambaku, Hollandë | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Rrënja e xhensenit, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Fletë tulipani, MB | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Rrënjët e Aspenit, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Ahu, Itali | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Dorëzimi i drejtpërdrejtë |
KAUF19 | Zhardhok patate, Arabia Saudite | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = nuk është depozituar
Tabela 2. Rezistenca e Ilyonectria crassa ndaj fungicideve
(substanca aktive) | EC50, ppm | ||||
Ditë 3 | Ditë 5 | Ditë 7 | |||
Kontrolluar | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenokonazol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Në punën tonë, shtamet e I. crassa ishin izoluar nga zhardhokët e patates në rajonet Kostroma dhe Moskë (Chudinova et al., 2019). Një përqindje e lartë e shtameve të kërpudhave me sekuencat e TIJ identike me I. crassa u zbulua kur analizohej mykobiota e zhardhokëve të patates në Arabinë Saudite (Gashgari dhe Gherbawy, 2013). Me sa duket, I. crassa nuk është aq e rrallë në patate sa mund të duket. Eksperimentet tona treguan se kërpudhat mund të infektojnë frutat e dëmtuara të domates. Dihet nga literatura se I. crassa është e aftë të zhvillohet në tokë në mënyrë saprotrofike (Moll et al., 2016), si dhe të ndikojë në një larmi bimësh, madje edhe të largëta taksonomikisht, siç janë daullet, zambakët, xhensen, aspen dhe ahu (Tabela 1). një) Me sa duket, shumë bimë të egra dhe kopsht mund të jenë rezervat e I. crassa. Më lart tregon se kur zhvilloni masa mbrojtëse, është e nevojshme të merret parasysh mundësia e prekjes së zhardhokëve të patates me këtë kërpudhat. Përgatitjet e përhapura për trajtimin e zhardhokëve të patates që përmbajnë fludioxonil, azoxystrobin dhe difenoconazole kanë treguar efikasitet të lartë fungicid kundër I. crassa.
Kjo punë u mbështet nga Fondacioni Rus për Kërkime Themelore (Grant Nr. 20-016-00139).
Artikulli u botua në revistën "Buletini i Mbrojtjes së Bimëve", 2020, 103 (3)