D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Kërpudhat fitopatogjene Colletotrichum coccodes shkaktojnë sëmundje të rrezikshme në patate dhe domate të njohura si antraknozë dhe njolla e zezë e zhardhokëve. Nga karakteristikat morfologjike, ato shpesh janë të vështira për tu dalluar nga sëmundjet e shkaktuara nga mikroorganizmat e tjerë; në frutat e domates së gjelbër, sëmundja mund të jetë asimptomatike, duke u shfaqur vetëm në frutat e kuqe të pjekura. Për diagnostikim të shpejtë dhe të saktë të patogjenit, ofrohet një sistem testimi PCR në kohë reale. Për të zhvilluar një sistem testimi, u përcaktua sekuenca nukleotidike e gjenit glukerol trifosfat dehidrogjenazë të shtameve 45 C. kokode të izoluara nga zhardhokët e patates në rajone të ndryshme të Rusisë.
Bazuar në rezultatet e marra dhe analizën e sekuencave të ngjashme të specieve të tjera të disponueshme në bazën e të dhënave GenBank, u krijuan abetaret specifike të specieve dhe sonda për C. coccodes. Për të kontrolluar specifikën e sistemit të testit të krijuar, PCR u krye me ADN të izoluar nga kulturat e pastra të 15 llojeve të ndryshme të kërpudhave parazitare dhe saprotrofike të shoqëruara me bimë domate dhe patate (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis Phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Prania e Colletotrichum coccodes DNA u përcaktua në një cikël pragu prej 20-27, ndërsa speciet e tjera u zbuluan pas 40 cikleve ose nuk u zbuluan. Sistemi i provës bën të mundur zbulimin e besueshëm të përqendrimeve të ADN-së C. kokode që tejkalojnë 0.01 ng / mm3 në përzierjen e PCR të analizuar. Duke përdorur sistemin e testit të zhvilluar, u hetua prania e C. coccodes në gjethet e domates me simptoma të sëmundjeve kërpudhore dhe në zhardhokët e patates pa simptoma të jashtme të sëmundjes. Gjethet me simptoma të infeksionit të kërpudhave u mblodhën nga dy fusha të ndryshme në Territorin e Krasnodarit, zhardhokët - nga fushat në rajonet Kostroma, Moskë, Kaluga, Nizhny Novgorod. Një gjethe domate që përmbante ADN të C. coccodes u gjet në Territorin e Krasnodarit; një prani e konsiderueshme e ADN-së e këtij patogjeni u zbulua në 5 mostra të zhardhokëve të rritur në rajonet Kostroma, Moscow, Kaluga.
Paraqitje
Kërpudhat e gjinisë Colletotrichum janë fitopatogjenë të rrezikshëm që prekin drithërat, perimet, bimët, frutat shumëvjeçare dhe bimët e manave. Një nga speciet e kudogjendshme të kësaj gjinie, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, është agjenti shkaktar i antraknozës dhe njollës së zezë të patateve dhe domateve dhe shkakton sëmundje të një numri të bimëve të tjera të familjes Solanaceae, përfshirë. barërat e këqija (Dillard, 1992). C. coccodes infekton të gjitha pjesët nëntokësore të bimës, bazat e rrjedhës, gjethet dhe frutat (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Në lëvoren e zhardhokëve të patates së infektuar, vërehet zhvillimi i njollave gri me skaje të theksuara në mënyrë të paqartë, në të cilat duken qartë pikat e zeza të sporulimit dhe mikrosklerotisë. Gjatë ruajtjes, ulçerat me përmbajtje të zbutur mund të formohen në tulin e zhardhokëve, d.m.th. sëmundja hyn në fazën e antraknozës, e cila, megjithatë, është jashtëzakonisht e rrallë.
Në të njëjtën kohë, simptomat e antraknozës (ulçera të lëkurës me pika të vogla të zeza) janë tipike për frutat e domates. Në gjethe, simptomat e C. coccodes shfaqen si njolla të errëta kafe, zakonisht kufizohen nga indet e verdha (Johnson, 1994).
Zhvillimi i njollës së zezë në zhardhokët prish pamjen e tyre, e cila është veçanërisht e theksuar kur shet patate të lara me lëvozhgë të kuqe. Lëkimi i lëvozhgës çon në avullim të tepërt dhe humbje në rritje të magazinimit (Hunger, McIntyre, 1979). Dëmtimi i organeve të tjera të bimës çon në humbjen e rendimentit, i cili u vu re në kushtet e tokës së hapur dhe të mbyllur (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Sëmundjet e shkaktuara nga C. coccodes janë të zakonshme në pothuajse të gjitha rajonet që prodhojnë patate të botës, përfshirë Rusinë (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Kontrolli i këtyre sëmundjeve është i vështirë për shkak të efikasitetit të pamjaftueshëm të fungicideve ekzistues kundër C. coccodes dhe mungesës së varieteteve rezistente (Read, Hide, 1995).
Inokulumi C. coccodes mund të vazhdojë në zhardhokët e farës (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), farat e domates (Ben-Daniel et al., 2010), mbijetojnë për një kohë të gjatë në tokë, në mbeturinat e bimëve (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) dhe në barërat e këqija (Raid, Pennypacker, 1987). Punimet e një numri autorësh (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) kanë treguar se zhvillimi i sëmundjes në patate dhe domate varet kryesisht nga prania e inokulit në farë dhe dheu Prandaj, për të minimizuar humbjet nga sëmundja, është e nevojshme të diagnostikoni (përfshirë sasinë) propagandat e kërpudhave në materialin farë, në tokë, në zhardhokët e patates së farës dhe farat e domates të vendosura për ruajtje. Diagnostifikimi morfologjik në tokën dhe materialin bimor mund të kryhet vetëm nga prania e mikroskleotrisë, të cilat, megjithatë, gjenden edhe në llojet e tjera të kërpudhave.
Simptomat në zhardhokët janë shumë të ngjashme me zgjebën e argjendtë të shkaktuar nga kërpudhat Helminthosporium solani. Izolimi i koksit Colletotrichum dhe Helminthosporium solani në një kulturë të pastër është mjaft i vështirë dhe kërkon një kohë të gjatë për shkak të rritjes së ngadaltë në një mjedis ushqyes. Për të identifikuar shpejt kokodet Colletotrichum, është e nevojshme të përdoren metoda diagnostike instrumentale. Metoda më e përshtatshme është reaksioni zinxhir i polimerazës (PCR) dhe modifikimi i tij - PCR në kohë reale. Aktualisht, një sistem testimi i zhvilluar nga studiuesit britanikë (Cullen et al., 2002) për rajonin ITS1 të rDNA përdoret në Evropë dhe Shtetet e Bashkuara. Përdorimi i tij ka treguar rezultate të mira në analizën e izolimeve ruse (Belov et al, 2018). Sidoqoftë, C. coccodes është shumë i ndryshueshëm dhe zbulimi i tij nga një sekuencë e ADN-së mund të çojë në rezultate false të gabuara. Për një diagnozë më të besueshme, kërkohet analiza për disa sekuenca speciale specifike të ADN-së, në lidhje me të cilat ne kemi zhvilluar një sistem origjinal të provës që lejon identifikimin e C. kokodeve nga sekuenca e gjenit dehidrogjenazë të gliceraldehid-3-fosfat dehidrogjenazës.
Materiale dhe metoda
Për të vlerësuar efektivitetin dhe specifikën e sistemeve të krijuara të provave, ne përdorëm kultura të pastra të 15 specieve të kërpudhave të izoluara nga autorët nga mostrat e sëmura të gjetheve dhe frutave të domates, zhardhokët e patates (Tabela 1). Për izolim, u morën organet e bimëve me simptoma të infeksionit të kërpudhave, jo më shumë se një organ për shkurre.
Një fetë e një zhardhoku me një lëvozhgë, një fetë e një fruti domate dhe një gjethe e prekur u vendosën nën një mikroskop dylir, pas së cilës miceli, sporet ose një copë indi u transferuan në një mjedis agar (agar wort) në një pjatë Petri me një gjilpërë disektive të mprehur. Izolat u ruajtën në pjerrësinë e agarit në epruvetat në 4 ° C.
Mostrat e gjetheve të domates me simptoma të sëmundjeve të kërpudhave, të destinuara për analiza, menjëherë pas mbledhjes (në fushë) u vendosën në 70% alkool etilik në të cilin ishin ruajtur deri në izolimin e ADN-së. Zhardhokët e patates u dorëzuan në laborator, qëruan (copë 2 × 1 cm) prej tyre dhe u ngrinë në –20 ° С. Ruhet i ngrirë deri në izolimin e ADN-së.
Kulturat e pastra të kërpudhave për izolimin e ADN-së u rritën në mjedis të lëngshëm të bizeleve. Miceli i kërpudhave u hoq nga mjedisi i lëngët, u tha në letër filtri, u ngri në azot të lëngët, u homogjenizua, u inkubua në tampon CTAB, u pastrua me kloroform, u precipitua me një përzierje të isopropanolit dhe 0.5 M acetat kaliumi, u la dy herë me 2% alkool. ADN-ja rezultuese u tret në ujë të deionizuar dhe u ruajt në –70 ° С (Kutuzova et al., 20). Përqendrimi i ADN-së u mat duke përdorur një çantë sasiore të ADN-së HS për ADN-në me dy fije në Qubit 2017 (Qiagen, Gjermani). Mostrat e alkoolizuara dhe të ngrira u copëtuan në azot të lëngët, pastaj u bë nxjerrja e ADN-së siç përshkruhet më sipër (për miceliumin e kulturave të pastra të kërpudhave).
Tabela 1. Origjina e llojeve të kërpudhave të përdorura
Emri i kërpudhës | Bimë, organ | Vendi i përzgjedhjes |
---|---|---|
Kokodet Colletotrichum 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | zhardhok patate | Rajoni i Kostromës, zhardhokët e patates të gjeneratës së parë të fushës, kultivari Red Scarlett |
Kokodet Colletotrichum 4 | fletë patate | Reps. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | zhardhok patate | Rajoni i Magadan, pos. Çadër, zhardhok patate |
Cladosporium fulvum | fletë domate | Rajoni i Moskës, domate me fruta të mëdha |
Alternaria tomatofila | fruta domate | dorëzuar nga stafi i laboratorit të mikologjisë dhe fitopatologjisë të Institutit Kërkimor Gjith-Rus të Mbrojtjes së Bimëve |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | fruta domate | Territori i Krasnodarit, rrethi Krymsky, krem notash |
Fusarium oxysporum | rrënjë gruri | Rajoni i Moskës |
PCR u krye në një amplifikator DTprime (ADN-Teknologji). Për PCR, u përdorën abetare origjinale dhe një sondë për rajonin specifik të specieve të gjenit glukol trifosfat dehidrogjenazë: abetare përpara Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, abetare e kundërt Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1). Abetaret amplifikojnë një rajon 213 bp.
Reagimi mori 50 ng ADN totale (në analizën e gjetheve dhe zhardhokëve) dhe 10 ng (në analizën e ADN të kulturave të pastra të kërpudhave). Përzierja e reaksionit (35 μl) u nda nga një shtresë parafine në dy pjesë: ajo e poshtme (20 μl) përmbante 2 μl tampon reaksioni 10 ((750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% ndërmjet - 20), 0.5 mM të secilit trifosfat deoksinukleotid, 7 pmol të secilit abetare dhe 4 pmol të një sonde fluoreshente të hidrolizueshme; e sipërmja përmbante 1 μl tampon PCR 10 er dhe 1 U polimerazë Taq.
Ndarja e përzierjes me parafinë lejon që tubat të ruhen për një kohë të gjatë në një temperaturë prej 5 ° C dhe të sigurojnë një fillim të nxehtë për PCR pasi t'i ngrohni për 10 min në një temperaturë mbi 80 ° C. PCR u krye sipas programit të mëposhtëm: 94.0 ° C - 90 s (1 cikël); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 cikle); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 cikle); 10.0 ° C - ruajtja.
Rezultate dhe diskutime
Sekuencat e gjenit glukerol trifosfat dehidrogjenazës u përcaktuan në 45 lloje të izoluara nga gjethet, rrjedhjet, zhardhokët e patates dhe frutat e domates (Kutuzova, 2018) në rajone të ndryshme të Rusisë. Sekuencat e studiuara të të gjitha shtameve u ndanë në 2 grupe që ndryshojnë në dy nukleotide. Sekuencat nukleotide të përfaqësuesve të të dy grupeve nën numrat KY496634 dhe KY496635 janë depozituar në GenBank.
Abetaret coc70gdf, coc280gdr dhe sonda cocgdz të hartuara në bazë të tyre u kontrolluan duke përdorur programin BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) në të gjitha sekuencat e gjenit glukol trifosfat dehidrogjenazë të specieve të gjinisë Colletotrichum dhe organizmave të tjerë të disponueshëm në bazën e të dhënave GenBank.
Nuk u gjetën rajone të ADN-së të organizmave të tjerë shumë homologë ndaj abetareve dhe sondave.
Ndjeshmëria e sistemit të provës u kontrollua duke përdorur mostra me përqendrime të ndryshme të ADN-së C. coccodes, ADN-ja e një gjethe patate të infektuar me antraknozë (mbledhur në 2017 në Mari El, varieteti Red Scarlett) dhe lëvozhga e zhardhokëve të prekur nga pika e zezë (e mbledhur në rajonin e Kostroma shumëllojshmëria Red Scarlett, Tabela 2). Për të konfirmuar praninë e ADN-së në zhardhokët dhe gjethet e patates, llojet e C. coccodes u izoluan prej tyre në kultura të pastra.
Rezultatet e analizës së ndjeshmërisë së sistemit të provës tregojnë se mund të përdoret për të diagnostikuar me sukses praninë e ADN-së C. coccodes në një mostër kur përmbajtja e tij totale në përzierjen PCR është më shumë se 0.05 ng. Kjo është mjaft e mjaftueshme për zbulimin, pasi që një sklerotia përmban, mesatarisht, 0.131 ng dhe një spore përmban rreth 0.04 ng ADN (Cullen et al., 2002). Sistemi i provës i zhvilluar nga grupi anglez (Cullen et al., 2002) tregoi një ndjeshmëri të ngjashme (cikli prag 34 në 0.05 ng ADN dhe 37 në 0.005 ng).
Analiza e mostrave natyrore që përmbajnë C. coccodes në të gjitha rastet bëri të mundur zbulimin e besueshëm të pranisë së tij në mostër (Tabela 2). Metoda e propozuar për izolimin e ADN-së ishte gjithashtu e zbatueshme për analizën e mostrave natyrore të bimëve.
Tabela 2. Përcaktimi i ndjeshmërisë së sistemit të propozuar të provës për identifikimin e kokodeve Colletotrichum për PCR në kohë reale
Образец | Sasia e ADN-së në mostër *, ng | Cikli prag | C. zbulimi i kokodeve |
---|---|---|---|
Kokodet e Mycelium Colletotrichum | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Lëvore zhardhoku 1 | 50 | 32 | + |
Lëvore zhardhoku 2 | 50 | 30 | + |
Lëvore zhardhoku 3 | 50 | 31.5 | + |
Gjethe patate | 50 | 29.5 | + |
Shënim. * Në një përzierje të produkteve PCR.
Specifika e sistemit të provës u testua në mostrat e ADN-së të nxjerra nga 15 lloje të kërpudhave. Të gjitha llojet e kërpudhave u izoluan nga autorët nga frutat dhe gjethet e prekura dhe të shëndetshme të domates, zhardhokët e patates; një farë ishte izoluar nga rrënja e grurit (Tabela 1). Midis specieve të izoluara nga sipërfaqja e frutave, ka edhe specie që nuk janë patogjene për domate (për shembull, Phellinus ferrugineovelutinus).
Studimet kanë treguar se ADN e C. coccodes u zbulua në një cikël pragu prej 20-27, ndërsa speciet e tjera kërpudhore nuk u zbuluan ose dhanë një sinjal pas ciklit 40, i cili mund t'i atribuohet një efekti jo specifik të zhurmës (Tabela 3).
Tabela 3. Kontrollimi i sistemit të provës për lloje të ndryshme të kërpudhave
Emri i kërpudhës | Cikli prag |
Kokodet Colletotrichum 1 | 20.9 |
C. kokodet 2 | 22.6 |
C. kokodet 3 | 23 |
C. kokodet 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticilium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Fomopsis fazoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatofila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phelinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemfili vezikarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Shënim. * Sasia e ADN-së në të gjitha mostrat ishte 10 ng.
Sistemi i zhvilluar i provës u përdor për të identifikuar C. coccodes në mostrat e gjetheve të domates me simptoma të patogjenëve nekrotrofikë dhe zhardhokëve të patates së farës pa simptoma të dukshme. Për studimin, ne morëm zhardhokë farëra të varieteteve të ndryshme të rritura në rajonet Kostroma, Moskë, Kaluga, Nizhny Novgorod. Prania e ADN-së C. coccodes u konsiderua e rëndësishme në mostra, në analizën e të cilave cikli prag nuk kalonte 35. Kjo vlerë e pragut u zgjodh bazuar në përcaktimin e besueshëm të 0.05 ng të ADN-së C. coccodes (cikli prag 33.5, Tabela 2) dhe faktin që ciklet e pragut mbi 40, u diagnostikua ADN jospecifik e disa specieve të tjera të kërpudhave. Me këtë qasje, prania e konsiderueshme e ADN-së C. coccodes u zbulua në 5 mostra të zhardhokëve të rritur në rajonet Kostroma, Moskë, Kaluga dhe në një fletë domate nga rrethi Yeisk i rajonit Krasnodar (Tabelat 4, 5).
Tabela 4. Zbulimi i kokodeve Colletotrichum në zhardhokët e patates *
Numri i kampionit | Varietet i patates | Vend në rritje | C. zbulimi i kokodeve | Cikli prag |
---|---|---|---|---|
1 | Skarlet i kuq | Rajoni Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Rajoni i Moskës | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky herët | Rajoni i Moskës | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | bythëqirë | Rajoni i Kalugës | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | fantazi | Rajoni i Kalugës | - | |
15 | festë e madhe | Rajonin e Nizhny Novgorod | - | |
16 | - |
Shënim. * Sasia e ADN-së në të gjitha mostrat ishte 50 ng.
Tabela 5. Zbulimi i kokodeve Colletotrichum në gjethet e domates *
Numri i kampionit | Vend në rritje | C. zbulimi i kokodeve | Cikli prag |
---|---|---|---|
1 | Territori i Krasnodarit, Rrethi i Krimesë | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Rajoni i Krasnodarit, rrethi Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Sasia e ADN-së në të gjitha mostrat ishte 50 ng.
Sistemi i provës i krijuar nga ne nuk është inferior me atë të zhvilluar nga studiuesit britanikë (Cullen et al., 2002) në ndjeshmëri dhe specifikë dhe është i përshtatshëm për analizën e mostrave të bimëve. Zbatimi i tij për analizën e zhardhokëve të farës bëri të mundur identifikimin e ADN-së C. coccodes në zhardhokë pa shenja të jashtme dëmtimi dhe për të analizuar me sukses infeksionin e gjetheve.
Deri më sot, në Rusi nuk është kryer asnjë analizë e zhardhokëve të patates për infektimin e C. coccodes. Studimi ynë i parë tregoi se nga 16 zhardhokët e farës së testuar të rritur në rajone të ndryshme të Federatës Ruse, 5 përmbajnë C. coccodes. Kjo tregon se njolla e zezë e zhardhokëve të patates është një sëmundje e zakonshme e patates në Rusi dhe roli i saj në zvogëlimin e vëllimit dhe cilësisë së të korrave të patates nënvlerësohet.
Analiza e gjetheve të domates zbuloi një prani të konsiderueshme të ADN-së C. coccodes në një fletë nga rrethi Yeisk i Territorit të Krasnodarit. Më parë, kur shqyrtoheshin fushat e domates në Rusinë jugore duke përdorur sistemin britanik të provës (Cullen et al., 2002), u gjetën gjethe që përmbajnë C. coccodes, dhe në disa fusha u gjet një pjesë e lartë e gjetheve të infektuara me C. coccodes (Belov et al., 2018) Në Territoret e Krasnodarit dhe Primorskit, rajoni i Moskës, gjetëm fruta të domates, nga të cilat arritëm të izolonim kultura të pastra të C. coccodes. Possibleshtë e mundur që C. coccodes është shumë më e përhapur në domate në Rusi sesa besohet tani, dhe dëmtimi i tij gjithashtu nënvlerësohet.
Kështu, deri më sot, është grumbulluar mjaft informacion mbi shpërndarjen e përhapur të C. coccodes në patate dhe domate.
Për të kuptuar më mirë rolin e kësaj kërpudhe në zhvillimin e sëmundjeve të patates dhe domates, është e nevojshme të monitorohet përhapja e saj në Rusi, të studiohet roli i infeksioneve të tokës dhe farës dhe roli i njollës së zezë në humbjet gjatë ruajtjes. Përdorimi i diagnostikimit PCR mund ta lehtësojë ndjeshëm këtë punë dhe përdorimi i njëkohshëm i të dy sistemeve të provës do të rrisë ndjeshëm saktësinë e analizës.
Kjo punë u mbështet nga granti i Fondacionit Rus Shkencës nr. 18-76-00009.
Artikulli u botua në revistën Mycology and Phytopathology (vëllimi 54, Nr. 1, 2020).